Coloides precisos con interacciones ajustables para microscopía confocal

Oct 07, 2023

Scientific Reports volumen 5, Número de artículo: 14635 (2015) Citar este artículo

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Los sistemas coloidales modelo estudiados con microscopía confocal han dado lugar a numerosos conocimientos sobre la física de la materia condensada. Aunque la microscopía confocal es una herramienta extremadamente poderosa, requiere una cuidadosa elección y preparación del coloide. Las variaciones incontroladas o desconocidas en el tamaño, la densidad y la composición de las partículas individuales y las interacciones entre las partículas, a menudo influidas por la ruta sintética seguida para formarlas, dificultan la interpretación del comportamiento de la dispersión. Aquí describimos la síntesis directa de partículas de copolímero que pueden combinarse simultáneamente con el índice de refracción y la densidad con una mezcla no plastificante de solventes de alto dieléctrico. Las interacciones entre las partículas se ajustan con precisión mediante el injerto superficial de cepillos de polímero mediante polimerización radical por transferencia atómica (ATRP), desde una esfera dura hasta una repulsión electrostática de largo alcance o una atracción de carga mixta. También modificamos la densidad de flotación de las partículas alterando la relación de copolímero mientras mantenemos su índice de refracción igualado a la solución de suspensión, lo que da como resultado una sedimentación bien controlada. La capacidad de ajuste de las interacciones entre partículas, la baja volatilidad de los disolventes y la capacidad de igualar simultáneamente el índice de refracción y la densidad de las partículas con el fluido abre nuevas posibilidades para explorar la física de los sistemas coloidales.

Los sistemas coloidales se utilizan para explorar la física de la materia condensada en tiempo real y en el espacio; Las observaciones del comportamiento de las partículas coloidales han dado lugar a una visión sin precedentes de fenómenos tan variados como la nucleación de cristales1 y la fusión2, el transporte defectuoso3, la formación de vidrio4,5, los fenómenos de humectación y capilaridad6 y el autoensamblaje y la unión específica7. A diferencia de sus homólogos atómicos, la estructura, la dinámica y las propiedades mecánicas de estas dispersiones son accesibles mediante microscopía óptica y dispersión de luz. Sin embargo, las limitaciones prácticas de cada una de estas técnicas y el diseño de experimentos individuales hace que el control sobre las propiedades físicas de las partículas constituyentes sea esencial. La microscopía óptica, que revela la estructura del espacio real de los coloides y la dispersión de la luz, que aclara la estructura y la dinámica en el espacio recíproco, se basa en el control preciso del tamaño y el índice de refracción de las partículas observadas: como la elección del tamaño de las partículas influye en la las escalas relativas de tiempo y longitud disponibles para el experimento y la cuidadosa coincidencia de los índices de refracción de las partículas y el fluido en suspensión minimizan los efectos de las aberraciones ópticas y la dispersión múltiple. Para estudiar la evolución de las muestras a escalas de tiempo largas es fundamental que la evaporación del disolvente sea mínima; esto es particularmente importante durante las mediciones reológicas en las que las suspensiones están expuestas al medio ambiente. Las tensiones gravitatorias, que no se pueden ignorar para las partículas de escala micrométrica, dan como resultado gradientes de densidad y sedimentación que afectan fuertemente las propiedades del material, como las tasas de nucleación de cristales8. Estos efectos perjudiciales de la gravedad se pueden minimizar haciendo coincidir la densidad de las partículas con la del fluido en suspensión: lo que permite el estudio del equilibrio, el comportamiento a granel. Sin embargo, un desajuste de densidad bien controlado puede ser deseable6,9,10, por ejemplo, al crear plantillas de estructuras cristalinas específicas en una superficie estampada11,12,13.

Además de las propiedades físicas de las partículas individuales y el fluido circundante, la estructura y la dinámica de las suspensiones coloidales también están determinadas por las fuerzas que las partículas ejercen entre sí14,15,16. La interacción más simple entre partículas sólidas es la de exclusión de volumen; en este llamado límite de esfera dura, se supone que las partículas son impenetrables y el comportamiento de fase se rige solo por la fracción de volumen de partículas. Dos sistemas experimentales de uso común que exhiben un potencial de interacción de esfera dura de este tipo y pueden tener un índice de refracción y una densidad equivalentes son las microesferas de poli(metacrilato de metilo) (PMMA) estabilizadas con un pincel de poli(ácido hidroxiesteárico) (PHSA-PMMA) dispersado en una mezcla de solventes orgánicos de bajo dieléctrico15,16 y sílice estearilada dispersa en fluidos halogenados17. Sin embargo, a pesar de la baja polaridad de estos solventes, pequeñas cantidades de impurezas ionizables disueltas en estos aceites pueden cargar las superficies de las partículas en formas que son difíciles de predecir y controlar16,18: confundiendo interacciones de esfera puramente dura. Además, el sistema de esferas duras más utilizado, PHSA-PMMA, a menudo se dispersa en mezclas fluidas en las que uno o más de sus componentes hinchan el polímero que compone las partículas, a veces hasta varias decenas de porcentajes. Se puede esperar que esto reduzca significativamente la temperatura de transición vítrea, suavizando las partículas y cambiando sus propiedades con el tiempo16. Finalmente, aunque este sistema en particular ha demostrado ser invaluable como sistema modelo coloidal, su síntesis es notoriamente difícil de reproducir. Se pueden diseñar interacciones más elaboradas entre partículas agregando polímeros o tensioactivos al fluido y modificando las superficies de las propias partículas. Los restos ionizables o los cepillos poliméricos injertados en la superficie de las partículas coloidales dan lugar a parámetros adicionales para controlar el comportamiento de fase de la suspensión19,20,21,22. Por ejemplo, las suspensiones de coloides con carga similar pueden organizarse en fases cristalinas de baja densidad con simetrías no accesibles para esferas duras19. Por el contrario, las mezclas de partículas coloidales con cargas opuestas pueden formar geles coloidales estructurados21,23 y superredes cristalinas binarias24,25. Sigue siendo un desafío sintetizar partículas coloidales con potenciales de interacción controlables y propiedades físicas predecibles pero flexibles, como la carga superficial, el índice de refracción y la densidad.

En este artículo, describimos la síntesis de un sistema modelo coloidal compuesto por partículas monodispersas que pueden tener simultáneamente un índice de refracción y una densidad equivalentes a mezclas de solventes polares no peligrosos que no plastifican las partículas cuyas superficies pueden modificarse con polímero. cepillos injertados utilizando Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP). Producimos partículas monodispersas de poli(metacrilato de trifluoroetilo -metacrilato de co-t-butilo) mediante polimerización en dispersión utilizando ingredientes disponibles comercialmente. Los cepillos de polímero injertados de la superficie de la partícula utilizando ATRP26 iniciado en la superficie median las fuerzas entre las partículas y pueden ajustarse con sensibilidad desde una esfera dura hasta una repulsión suave y de largo alcance. Las mezclas de estas partículas, funcionalizadas con cepillos de carga opuesta, muestran una agregación impulsada por carga reversible21,22. El índice de refracción y la densidad de estas partículas se pueden ajustar alterando la relación de copolímero. Finalmente, preparamos estas partículas de copolímero que contienen un núcleo fluorescente y una cubierta no fluorescente que mejora la precisión de la localización de partículas en experimentos confocales 3D densamente empaquetados27,28.

Las limitaciones experimentales de muchos sistemas coloidales son a menudo una consecuencia directa del material que compone las partículas dispersas. El índice de refracción relativamente bajo, n, de las partículas de sílice se puede igualar a una amplia variedad de mezclas de disolventes, pero igualar su densidad relativamente alta, ρ, es un desafío. Por el contrario, la baja densidad de las partículas de poliestireno se puede igualar, por ejemplo, con mezclas de H2O/D2O, pero su n es demasiado alta para igualar, lo que dificulta el estudio de sistemas concentrados por métodos ópticos. Por el contrario, los polímeros de metacrilato presentan índices de refracción y densidades que se pueden igualar simultáneamente. Esto se hace tradicionalmente en disolventes halogenados apolares, que hinchan y plastifican las partículas y en los que las interacciones de carga son difíciles de controlar16.

Aquí desarrollamos un sistema coloidal que se puede suspender en disolventes polares, en el que el índice de refracción y la densidad se pueden controlar con precisión y cuyas interacciones se pueden ajustar utilizando métodos de polimerización por radicales vivos controlados, ilustrados en la Fig. 1. Polímeros de metacrilato fluorado, como poli (metacrilato de trifluoroetilo), tienen índices de refracción relativamente bajos, n ≤ 1,415, pero una densidad muy grande, ρ ∼ 1,538 g/ml. Por el contrario, los polímeros de metacrilato alifático tienen densidades que disminuyen con la longitud del grupo alquilo: ρ∼ metacrilato de metilo > metacrilato de etilo > metacrilato de t-butilo, pero presentan índices de refracción relativamente altos, nPMMA ≈ 1,495. La combinación de estos dos tipos de monómeros en diferentes proporciones molares produce un copolímero cuya densidad e índice de refracción se pueden ajustar; una estrategia similar para ajustar el índice de refracción del sistema PMMA se informó anteriormente29. Aquí elegimos una combinación de metacrilato de trifluoroetilo (TFEMA) y metacrilato de terc-butilo (tBMA). Los homopolímeros de cada uno presentan las siguientes propiedades: PTFEMA [ρ = 1,53 g/ml, n = 1,4185] y PtBMA [ρ = 1,022 g/ml, n = 1,4630]. La copolimerización por dispersión de TFEMA y tBMA produce partículas con una polidispersidad de tamaño muy bajo, típicamente CV ≤ 5% (Fig. 2, ver SI). El tamaño de partícula se puede ajustar con precisión desde ∼ 0,55 μm–8 μm cambiando el tipo y la cantidad de codisolvente y la fracción de volumen de monómero cargada durante la polimerización por dispersión, consulte la Fig. 3. En una proporción de 28:72 de TFEMA:tBMA , por volumen, las partículas tienen una densidad relativamente baja, ρ = 1,16 g/ml, índice de refracción, n = 1,452 y alta temperatura de transición vítrea, Tg ∼ 86 °C, medida por calorimetría diferencial de barrido mientras están en la solución de suspensión. Esta relación de comonómero se elige específicamente para que el índice de refracción y la densidad coincidan con los coloides en una mezcla de disolventes polares, formamida y sulfolano.

Representación esquemática de la síntesis y modificación superficial de coloides copoliméricos por polimerización por dispersión y ATRP.

Imagen de microscopía electrónica de barrido (SEM) de partículas con un (A) diámetro promedio de 1,4 μm (B) y un diámetro promedio de 1,8 μm. La barra de escala en ambas imágenes es de 20 μm.

(A) Diámetros de partículas estabilizados con PVP con cambios en el tipo de codisolvente e ínmero, consulte la tabla en SI. H2O, sin ínmero; H2O, ínmero de acrilato; H2O, ínmero de metacrilato; formamida, ínmero de acrilato; formamida, ínmero de metacrilato. (B) Diámetros de partículas estabilizados con SPMA con codisolvente, H2O, volumen variado junto con la fracción de volumen de monómero total, consulte la Tabla en SI. 15 % en volumen de monómero; 12,5 % en volumen de monómero; 10% en volumen de monómero; 5% en volumen de monómero. Las composiciones de reacción dentro de las regiones sombreadas producen solo coágulos polimerizados.

El comportamiento de fase y la dinámica de los sistemas coloidales depende sensiblemente de las interacciones de pares entre las partículas. Ajustar estas interacciones permite la creación de una amplia variedad de estados líquidos y sólidos. Normalmente, las interacciones entre partículas son el resultado de restos en la superficie de la partícula que se originan a partir de la síntesis, como cargas residuales de iniciadores o estabilizadores. Aquí presentamos un método que ofrece un control preciso de la funcionalidad de la superficie en un paso de modificación posterior a la síntesis separado, utilizando la polimerización por radicales de transferencia atómica iniciada en la superficie26. Durante la polimerización por dispersión de las partículas, incorporamos covalentemente un iniciador ATRP30. Si bien la copolimerización del iniciador con la mayor parte del polímero de partículas es aleatoria, el ínmero en sí permanece soluble y, por lo tanto, se enriquece en la superficie de la partícula donde permanece accesible para el paso de modificación posterior. La inclusión de este monómero funcional no influye en el tamaño de las partículas ni en la polidispersidad, como se muestra en la Fig. 3. Para confirmar que el iniciador ATRP permanece activo después de la polimerización por dispersión, cultivamos un cepillo de un monómero fluorescente en la superficie de las partículas. Si bien el grosor de este cepillo está muy por debajo del límite de difracción, se distingue claramente un halo fluorescente alrededor de cada partícula cuando se obtienen imágenes con microscopía confocal, lo que indica una modificación superficial uniforme a pesar de la presencia de una capa de polímero estérico, como se muestra en la Fig. 4A.

(A) Imagen de microscopía confocal 2D de partículas no marcadas con fluorescencia con un 'halo' fluorescente indicativo de un cepillo crecido a partir de la superficie coloidal por ATRP. La barra de escala es de 10 μm. (B) Densidad de carga superficial calculada, usando la ecuación. (1), después de ATRP con diferentes relaciones molares de monómero aniónico a neutro. Recuadro: valores de potencial ζ medidos en TRIS 10 mM, pH 7,5.

Por lo general, el grado de polimerización de estos cepillos está determinado por la relación molar de monómero a moléculas de iniciador de superficie; sin embargo, se desconoce el número exacto de iniciadores de ATRP en la superficie de la partícula y, por lo tanto, el número de cadenas de polímero en crecimiento. En cambio, controlamos el peso molecular de las cadenas en crecimiento agregando un iniciador de sacrificio a la reacción en masa a una concentración significativamente mayor que el número máximo de posibles grupos reactivos presentes en la superficie de la partícula. Nuestro enfoque tiene el beneficio adicional de que las polimerizaciones operadas con un gran exceso de iniciador de sacrificio son menos sensibles a los inhibidores, las impurezas y las pequeñas variaciones del procedimiento. Usamos este enfoque para preparar cepillos de copolímero de dimetilacrilamida neutra, DMA y sulfopropilacrilamida aniónica, SPAm, en diferentes proporciones molares de los dos monómeros. De esta manera, la densidad de carga de la superficie y, por lo tanto, las interacciones coloidales, pueden ajustarse con cuidado y reproducibilidad. La densidad de carga superficial de estas partículas se calcula usando los potenciales ζ medidos y usando la siguiente relación empírica31:

donde es la densidad de carga superficial, ε es la constante dieléctrica del fluido en suspensión (∼82), ε0 es la permitividad del vacío, k es la constante de Boltzmann, T es la temperatura absoluta, e es la carga elemental, κ es el apantallamiento de Debye inverso longitud y . Al ajustar la proporción de monómero neutro a cargado, controlamos la densidad de carga final en las partículas, de neutral a altamente cargada, lo que no es posible con otros sistemas coloidales y permite la coincidencia del índice de refracción y la densidad (Fig. 4B).

Una vez que se forman las partículas, se modifican sus superficies y se incorpora una etiqueta fluorescente, estos coloides se pueden usar para experimentos de microscopía confocal solo si el fluido de suspensión cumple con ciertos criterios experimentales: no volátil, alta constante dieléctrica y coincide tanto con el índice de refracción como con la densidad de los coloides Además, el fluido no debe hincharse ni ablandar la partícula, lo que provoca una degradación gradual de las partículas, cambios en la fracción de volumen y fugas de fluoróforo no unido covalentemente de la partícula. Todos estos requisitos se cumplen eligiendo una proporción específica de comonómero del polímero que compone la partícula, de modo que una mezcla de 72:28 en volumen de solución de formamida y sulfolano coincida tanto con el índice de refracción como con la densidad de las partículas. La diferencia de densidad entre el fluido y la partícula de copolímero es mínima, confirmada por la ausencia de signos visuales de sedimentación o formación de crema incluso después de la centrifugación a 20 000 g durante 48 horas. Además, esta mezcla no plastifica las partículas, como se infiere al observar que no hay fugas de fluoróforo en el fluido de suspensión, incluso después de un almacenamiento de más de 2 años. Curiosamente, esta mezcla de disolventes tiene una constante dieléctrica de ε ∼ 82, casi la misma que la del agua32.

Esta mezcla de solventes altamente polares permite la disolución de grandes concentraciones de electrolito para detectar la repulsión de carga, lo que hace que las interacciones entre los coloides parezcan esferas duras. Tomamos una suspensión de coloides marcados con fluorescencia, modificados con un cepillo de copolímero de DMA y SPAm, en una fracción de volumen ϕ = 0,42 ± 2 y agregamos 50 mM de cloruro de sodio para filtrar las cargas superficiales. A partir de imágenes de microscopía de fluorescencia confocal, extraemos posiciones de partículas en tres dimensiones a partir de las cuales se calcula la función de distribución radial, g(r). Esta función de correlación de pares en este régimen de fluidos se puede describir con precisión mediante la aproximación de cierre de Perkus-Yevick para esferas duras puras, consulte la Fig. 5, lo que confirma que las interacciones se producen únicamente mediante la exclusión de volumen. Observamos que, dado que las partículas no se hinchan con ninguno de los dos solventes utilizados aquí, las fracciones de volumen determinadas a partir del conteo de partículas en microscopía confocal tridimensional y las determinadas a través de la evaporación de solventes con análisis termogravimétrico, o por sedimentación, son idénticas a las indicadas. error experimental16.

Función de distribución radial 3D, g(r), normalizada por radio de partícula, a de SEM.

(o) potencial de interacción similar a una esfera dura (ϕ ∼ 0,40, NaCl 50 mM); (línea continua) comportamiento de esfera dura calculado utilizando la aproximación de Percus-Yevick. Recuadro: () función de correlación de pares para el cristal de Wigner (ϕ ∼ 0,40, ∼ 0 mM NaCl); las líneas discontinuas son posiciones compactas hexagonales. El pico vecino más cercano se desplaza a r/a ∼ 1,24, lo que indica un potencial de interacción repulsiva de largo alcance.

Curiosamente, si tomamos las mismas partículas coloidales en una fracción de volumen idéntica y desionizamos la mezcla de fluidos para eliminar cualquier especie iónica e impurezas, las partículas comienzan a interactuar a través de repulsiones electrostáticas de largo alcance. La conductividad de la formamida tal como se recibe es de 68 μS/cm y la del sulfolano es de 6,6 μS/cm. Después de la desionización con resinas de intercambio iónico de lecho mixto, la conductividad disminuye a 1,0 μS/cm y 0,23 μS/cm, respectivamente. Si bien la muestra filtrada en una fracción de volumen por debajo del límite de congelación para esferas duras exhibió una estructura fluida, las partículas en esta mezcla desionizada de ajuste de índice de refracción y densidad cristalizan debido a las repulsiones electrostáticas, formando el llamado cristal de Wigner coloidal (Fig. . 6A,B), en el que se observan picos distintos y agudos en la función de distribución radial (recuadro Fig. 5).

(A) Rebanadas de microscopía confocal 2D x–y de un cristal de Wigner; partículas a ϕ ∼ 0,40 en una solución desionizada, con índice de refracción y densidad equivalente. La barra de escala es de 20 μm. Recuadro: mayor aumento, con una barra de escala de 2 μm. (B) reconstrucción de partículas 3D a partir de ubicaciones de partículas; distancias en micras, a partir de 15 μm del cubreobjetos. (C) Imágenes de microscopía confocal 2D de geles coloidales de índice de refracción y densidad combinados compuestos por partículas de 1,85 μm de diámetro con una carga superficial aniónica (verde) y catiónica (roja) en NaCl ∼0 mM.

Cuando las mismas partículas, marcadas con un colorante fluorescente amarillo, se mezclan con partículas del mismo lote cuya superficie ha sido funcionalizada con un cepillo de polímero catiónico y contienen un colorante fluorescente rojo, la atracción de carga entre las especies con carga opuesta da lugar a la formación de geles ensamblados electrostáticamente (Fig. 6C). Dichos geles muestran un comportamiento claramente diferente de las redes coloidales formadas por una agregación específica en una dispersión de un solo componente21,22.

Si bien este sistema de partículas compuesto por 2 monómeros y una mezcla fluida de solo 2 componentes permite una coincidencia casi perfecta de las densidades, ciertos experimentos pueden requerir una discrepancia de densidad controlada, por ejemplo, para la creación de plantillas de cristales en sustratos estampados11,12,13, o para determinar la ecuación de estado.33 En el sistema que presentamos aquí, los cambios mínimos en la relación del copolímero permiten hacer exactamente esto. Estos cambios no influyen en el tamaño de partícula o la polidispersidad que se muestra en la Fig. 3. Para mostrar esto, preparamos partículas que pueden tener un índice de refracción perfectamente igualado en formamida pura, pero que exhiben una leve falta de coincidencia de densidad de 0,077 g/cm3. Una muestra a ϕ ≈ 0,02 se equilibra durante 2 días, durante los cuales se forma un sedimento cristalino, se hace evidente una interfaz cristal-líquido nítida y distinta. La coincidencia del índice de refracción nos permite obtener imágenes muy profundas en la muestra, como se ve en la imagen de microscopía confocal en la Fig. 7, que muestra una profundidad de penetración del láser de excitación de más de 220 μm en la muestra, sin aberraciones ópticas significativas incluso en la dirección perpendicular al plano de exploración confocal.

Corte confocal XZ profundo de partículas de 1,65 μm de diámetro coincidentes pero de densidad no coincidente dispersadas en formamida con NaCl 30 mM.

Finalmente, mostramos que las mismas partículas se pueden crear en una variante de núcleo-capa, en la que un núcleo fluorescente está incrustado en una capa no fluorescente. Dicha arquitectura de núcleo-carcasa es particularmente útil para estudios de suspensiones densas en las que puede ser difícil localizar centroides de partículas con alta precisión. Se sabe que la separación de los centros fluorescentes de las partículas con una capa no fluorescente del mismo material mejora en gran medida la resolución y la precisión de los algoritmos de localización de partículas27.

Preparamos partículas de núcleo-cáscara mediante polimerización de dispersión de semillas en presencia de partículas de núcleo reticuladas en las que un tinte fluorescente se une covalentemente a las cadenas de polímero. Estos núcleos reticulados se preparan mediante polimerización por precipitación, que produce partículas monodispersas con una superficie limpia sin dispersantes ni tensioactivos34 (Fig. 8A). Estas polimerizaciones se realizan en fracciones de bajo volumen de monómero; las reacciones en las que la concentración de monómero se incrementó a >5% en volumen y con concentraciones de agente de entrecruzamiento superiores al 2% en volumen produjeron un número indeseablemente grande de dímeros y trímeros. Posteriormente, se forma una capa no fluorescente alrededor de las partículas del núcleo reticulado mediante una polimerización por dispersión sembrada. Durante la polimerización, la relación codisolvente determina el tamaño de partícula máximo posible; la nucleación secundaria se puede evitar usando cantidades bajas de codisolvente. Esto da como resultado altos rendimientos de partículas monodispersas de núcleo y cubierta (Fig. 8B), cuya superficie se puede funcionalizar usando el mismo procedimiento ATRP iniciado en la superficie que se discutió anteriormente. La imagen confocal de estas partículas produce centros fluorescentes claramente separados, incluso cuando las partículas están en contacto directo (Fig. 8c).

(A) Imagen SEM de las partículas del núcleo, una imagen SEM de ∼ 710 nm (B) Imagen SEM de las partículas finales, una imagen de microscopía confocal 2D de ∼ 1,8 μm (C) del núcleo fluorescente con contornos de capa (líneas punteadas) determinados por campo brillante simultáneo microscopía, no se muestra. La única partícula pequeña que se ve en (B) es un núcleo de (A) que no se encapsuló durante la polimerización de la cubierta. La barra de escala en todas las imágenes es de 2 μm.

En este documento, presentamos un método completo para producir partículas coloidales monodispersas, cuyo índice de refracción y densidad se pueden adaptar y cuyas interacciones se pueden ajustar con precisión mediante el crecimiento iniciado en la superficie de cepillos de polímero. La coincidencia simultánea del índice de refracción y la densidad, en un solvente no volátil, no peligroso y polar, permite obtener imágenes cuantitativas de alta resolución de estos sistemas con microscopía confocal tridimensional. Además, ajustando la composición del cepillo de polímero en la superficie y controlando la fuerza iónica del medio de suspensión, ajustamos las interacciones de tipo esfera dura, donde la exclusión de volumen por sí sola gobierna su comportamiento de fase, a repulsión o atracción de largo alcance. La síntesis que describimos utiliza ingredientes que están fácilmente disponibles y cuyo procedimiento es altamente reproducible. Esto resuelve muchas de las limitaciones impuestas por los sistemas experimentales de uso común para explorar la física y la química física de las dispersiones coloidales. Además, debido a la polaridad del medio de suspensión, nuestros sistemas abren el camino a la preparación de partículas que exhiben interacciones específicas, por ejemplo utilizando motivos supramoleculares, que permiten el estudio del autoensamblaje coloidal dirigido en tres dimensiones y en ausencia de gravitación. hace hincapié

Todos los materiales se compran a Sigma-Aldrich y se usan tal como se reciben, a menos que se indique lo contrario.

La mayoría de las polimerizaciones de partículas que utilizan polivinilpirrolidona, PVP, como estabilizador estérico se llevan a cabo en un matraz de fondo redondo de 200 ml que se agita en un baño de glicerol calentado con un agitador superior. Las mezclas de polimerización típicas se dan en el SI. Una reacción de dispersión procede de la siguiente manera: metanol (90,0 ml), agua desionizada (10,0 ml), metacrilato de 2,2,2-trifluoroetilo (2,8 ml, FEMA, SynQuest Laboratories), metacrilato de t-butilo (7,2 ml, tBMA, TCI America ) en una proporción de 28:72 en volumen, polivinilpirrolidona (4,0 g, PVP K30), el ínmero (2-(2-bromoisobutiriloxi) acrilato de etilo o 2-(2-bromoisobutiriloxi) metacrilato de etilo, 0,5 ml, véase SI para la síntesis protocolo) y se añaden al matraz de reacción 0,1 g de 2,2',-azobis(2-metilpropionitrilo) (AIBN). El matraz se lleva al vacío y posteriormente se purga con nitrógeno, lo que se repite varias veces para obtener condiciones libres de oxígeno. Luego, la mezcla de reacción se gira lentamente a ≈75 rpm en un baño de glicerol a 55 °C durante 16 horas. Las partículas resultantes se lavan mediante centrifugación repetida y redispersión en una mezcla de agua y metanol 1:1. Las polimerizaciones son invariantes al volumen de reacción total; se han llevado a cabo volúmenes de reacción de hasta 1000 ml sin cambios en el tamaño de partícula final y la polidispersidad.

Las partículas de núcleo reticulado se preparan usando polimerización por precipitación usando un comonómero cargado de metacrilato de 3-sulfopropilo (SPMA), llevado a cabo en un matraz de fondo redondo de 200 ml equipado con un condensador de reflujo. En el SI se proporciona una descripción detallada de las mezclas de reacción. Una reacción de polimerización típica se desarrolla de la siguiente manera: metanol (80,0 ml), agua desionizada (22,0 ml), metacrilato de 2,2,2-trifluoroetilo (1,45 ml), metacrilato de t-butilo (3,9 ml), sal de potasio SPMA (0,055 g) , ínmero de acrilato (0,100 ml, 2 % en volumen en monómero), dimetacrilato de etilenglicol (0,107 g, 2 % en volumen en monómero), una solución de monómero fluorescente, metacrilato de rodamina B o metacrilato de cumarina (ver SI para el procedimiento sintético, 1,0 ml, 2 % en peso en metanol) y AIBN (0,055 g) al matraz de reacción. A continuación, el matraz de reacción se calienta a reflujo, sin desgasificar, a ~80 °C durante 5 horas. Una vez completadas, las partículas se lavan mediante centrifugación repetida y redispersión (5X) en una mezcla de agua y metanol 1:1. La unión covalente exitosa de los fluoróforos se verifica suspendiendo partículas reticuladas en tetrahidrofurano (THF) en el que mantienen una forma esférica y una fuerte fluorescencia, sin fluorescencia visible en el solvente de suspensión. Se cultiva una capa no fluorescente alrededor de los coloides usando polimerización por dispersión sembrada, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. El grosor de la cubierta se puede ajustar por la proporción de partículas de semillas fluorescentes con respecto al monómero total.

El ínmero que se copolimeriza durante la polimerización por dispersión permite el uso de ATRP para hacer crecer directamente un polímero desde la superficie del coloide26. Para controlar el grado de polimerización del polímero en crecimiento, se agrega a la solución un iniciador de ATRP de sacrificio, que se supone que tiene un gran exceso de las moléculas de ínmero de superficie disponibles35. Este iniciador de sacrificio (PEGini) se sintetiza de manera idéntica al ínmero de acrilato intercambiando acrilato de 2-hidroxietilo por éter metílico de poli(etilenglicol), Mn = 550. Una modificación típica de la superficie se realiza de la siguiente manera: formamida (FM, 32 ml), agua ( 26 ml), PEGini (1,25 ml, 2,26 mmol), sal sódica del ácido 2-acrilamido-2-metil-1-propanosulfónico (SPAm, 10,1 mmol, 50 % en peso en H2O), dimetilacrilamida (DMA, 47,1 mmol), 1,1 ,4,7,10,10-hexametiltrietilentetramina (HMTETA, 2,38 mmol), Cu(II)Cl2 (1,13 mmol) se añaden a un matraz de 200 ml que contiene la suspensión de partículas (65 ml, 25 % de sólidos, en 2:1 H2O :FM). La relación molar entre monómero:PEGini:cobre:ligando es [25:1:1:1,05]. La suspensión se burbujea con nitrógeno o argón durante al menos 20 minutos para eliminar el oxígeno disuelto, luego se agregan 1,13 mmoles de Cu(I)Cl al matraz para iniciar la polimerización y se agita durante varias horas (≥ 6 horas). Se prepara un cepillo de polímero marcado con fluorescencia a partir de metacrilato de fluoresceína 3:1 en masa de 2,2-bipiridil:Cu(II)Br en 2:1 en volumen de FM:H2O. La reacción se inicia con 5 mg de ácido ascórbico y se deja proceder durante 1 hora.

Las partículas se lavan en formamida desionizada (FM), con una conductividad de σ = 1,00 μS. Se añade gota a gota tetrametilsulfonona desionizada (SF, σ = 0,23 μS) a una suspensión de partículas en una fracción de volumen de ϕ ∼ 0,40 hasta que la muestra es transparente según se juzga visualmente. La coincidencia de densidad se verifica centrifugando la dispersión a 3000 g durante 6 horas. La mezcla de fluido de suspensión se ajusta hasta que no se observa sedimentación ni formación de crema. Al sintetizar los coloides a partir de una relación volumétrica específica de monómeros (FEMA:tBMA, 28:72), tanto el índice de refracción como la densidad se combinan simultáneamente con una mezcla de FM y SF a 72:28 por volumen. La mezcla de fluido de suspensión final tiene una constante dieléctrica estimada de ε ∼ 8232. Se agrega una resina de intercambio iónico de lecho mixto (Dowex Marathon MR-3) para desionizar aún más la mezcla de fluido de suspensión para controlar las interacciones de carga.

Los tamaños de partículas y las polidispersidades se miden tanto con microscopía de campo claro como con microscopía electrónica de barrido (SEM, Zeiss Supra 55). Definimos el coeficiente de variación, CV, como la desviación estándar sobre el radio medio de la partícula, . Se permite que las muestras con índice de refracción y densidad coincidentes se equilibren durante varias horas en cámaras de muestra selladas herméticamente, después de lo cual se registran pilas de imágenes 3D utilizando un microscopio de fluorescencia confocal (Leica SP5). Las funciones de distribución radial se calculan utilizando algoritmos estándar de localización de partículas36. Los potenciales zeta se miden con un Malvern Zetasizer Nano ZS en suspensiones de partículas diluidas en tampón PIPES 10 mM a pH 7,0. La temperatura de transición vítrea de las partículas de copolímero en las mezclas de coincidencia de índice y densidad se mide con calorimetría diferencial de barrido (TA Instruments, Q200).

Cómo citar este artículo: Kodger, TE et al. Coloides precisos con interacciones ajustables para microscopía confocal. ciencia Rep. 5, 14635; doi: 10.1038/srep14635 (2015).

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Este trabajo fue apoyado por Harvard MRSEC (DMR-1420570).

Escuela de Ingeniería y Ciencias Aplicadas, Universidad de Harvard, Cambridge, 02138, EE. UU.

Thomas E. Kodger

Departamento de Física, Universidad de Harvard, Cambridge, 02138, MA, EE. UU.

Rodrigo E. Guerra

Química física y materia blanda, Universidad de Wageningen, Dreijenplein 6, Wageningen, 6703, HB, Países Bajos

Jorge Sprakel

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TEK, RG y JS concibieron conjuntamente los experimentos, llevaron a cabo la síntesis y la caracterización y coescribieron y revisaron el manuscrito.

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Reimpresiones y permisos

Kodger, T., Guerra, R. & Sprakel, J. Coloides precisos con interacciones sintonizables para microscopía confocal. Informe científico 5, 14635 (2015). https://doi.org/10.1038/srep14635

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Recibido: 15 junio 2015

Aceptado: 02 de septiembre de 2015

Publicado: 30 de septiembre de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep14635

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